细胞蛋白质提取实验

1、准备实验台面（保持干净）

2、PBS清洗

自细胞间取出细胞，吸弃培养瓶内液体，使用常温PBS清洗一遍，吸弃。此后，所有操作均在冰浴上进行。

3、细胞裂解

每瓶细胞加入250~350μL裂解液，铺匀裂解液，冰浴裂解10min。其间重复铺匀裂解液数次。铺匀裂解液的手法同胰酶消化细胞。等待裂解期间，再次确认离心机、恒温箱及水浴锅的温度。

4、刮取细胞

裂解时间到后，使用细胞刮刀刮下细胞。每个刮细胞的动作均需粘上裂解液，自上向下保持一个方向刮，动作如刮洗玻璃。

5、转移样本

使用200μL移液枪将刮下的细胞悬液转移至1.5mL离心管（刮完一个样品就马上转移），并反复吹打30~60次，充分破碎细胞。吹打过程尽量避免反复打入气泡，毕竟富含蛋白质的液体十分容易起泡。吹打完成后，装有样品的离心管插于冰上。

6、重复步骤5，完成所有样本收集

将第5步中使用的细胞刮刀，依次在三个烧杯中涮洗，轻轻甩干（文明操作，勿甩的到处飞溅），插于试管架上晾干。刮取下一瓶细胞时，可用另一把刮刀，三把刮刀（或更多刮刀）交替使用，足够在交替期间晾干。此处强调，若刮刀未涮洗干净，则出现样品交叉污染，若细胞未晾干，则导致样品稀释。

7、进一步冰浴裂解

所有样品刮取并转移至离心管后，继续冰浴裂解5~10min。期间再次确认离心机、恒温箱、水浴锅情况。不同课题组间情况各异，要知道，实验员较多的课题组可能管理起来较为混乱，应对突发情况（例如准备好的仪器被他人动了）的最好方式，就是在仪器边上留个便签字条，并在任何能够休息的间歇中多次确认仪器情况。

8、离心

裂解完成后，12000g，4℃，离心5min。

9.收集蛋白上清

取上清液，并记录取样量，后续加入相应体积的SDS上样缓冲液，备煮样。