细胞RNA提取实验

RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注重配带手套口罩帽子，不要交流，打喷嚏，样品尽可能盖严。

1、细胞。取出六孔板，弃去培养基，用预冷的PBS洗2遍，一定要把PBS吸干净。加入1ml Trizol裂解细胞，用细胞刮刮下细胞，转移到一个新的无酶1.5ml EP管中，室温静置5min（使核酸蛋白复合物完全分离）。

B、组织。50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，如果你不想去称量，用匀浆器匀浆（匀浆器需要在用之前用DEPC水泡过，消毒）。转移到一个新的无酶1.5ml EP管中，室温静置5min。

2、加氯仿1/5 Trizol体积 ，把EP管盖子盖紧，用手上下左右晃动10次左右(摇晃时应注意离心管盖以防未盖紧使溶液漏出)，使其混匀（在室温下静置5-10 min（避免涡旋震荡，以免DNA链断裂）。然后，运用低温离心机4℃，1,0000 rpm/min，离心15min。分为3层，水相层包含RNA在上层，有机层在下层，中间层是DNA和蛋白质。

3、小心吸取上清液，切忌吸出白色中间层，转移至另一新的无酶EP管中。加入等体积的异丙醇（大约为500μl），用手上下摇晃，室温静置10min。低温离心机4℃，离心15min，12,000 rpm/min。

4、倒掉上清液，加1ml 75%无水乙醇 ，用手轻轻震动洗涤管壁，低温离心机4℃，离心5min，12,000 rpm/min，为了避免减少盐物质及碳源物质干扰，此处建议用75%无水乙醇清洗两次。

5、上清倒掉，放置室温（EP管倒置在滤纸上），使RNA干燥沉淀（注意不要加热干燥或离心，要不然RNA将很难溶解）。加DEPC水30μl于EP管中。

6、测RNA浓度：将仪器打开，先用DEPC水调零（3次）。吸取1-2μl待测RNA，慢慢滴于仪器上，记录RNA浓度值，以便在逆转录时使用。同时至少要记录260/280值（1.8-2.1），纯RNA的OD260/OD280的比值为2.0。

7、逆转录：将RNA溶液快速离心，同时将无酶EP管放于冰上，配置10μl的体系，加gDNA Eraser 1μl，5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl，RNA溶液质量根据浓度计算最好超过1μg（RNA浓度最好在500-1000），最后加RNase free ddH2O至10μl，用涡旋震荡混匀。将反应液置于室温5min。加入上述变性、退火反应后的EP管中，为20μl体系。