细胞增殖分析

CCK-8法

• 一、实验原理

在电子耦合试剂存在的情况下，WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐），可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan），其颜色的深浅与细胞增殖成正比，与细胞毒性成反比，对同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，可以间接反映活细胞的数量。

二、用途：可用于细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。

三、实验步骤

1、种板数：根据你摸索的，或者查阅文献确定你需要的种板浓度，根据种板浓度对细胞悬液进行稀释，通常细胞增殖实验每孔加入约1000-2000个细胞100ul，细胞毒性实验每孔加入约5000～10000个细胞100ul（具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定）。

2、种板：以96孔板为例，96孔板横向是1-12的数字，纵向是A-H，可做多个实验组，每组设置4-6个复孔，同时设置空白组，最边缘孔加入PBS缓冲液减少蒸发带来的影响，然后将细胞置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中培养12-24 h。

3、加药及加药后孵育时间：观察细胞细胞贴壁良好，吸出各孔培养基，实验组加入含不同浓度药物的培养基，空白组加入不含药物培养基，然后将96孔板在37℃ 5% CO2空气的细胞培养箱中孵育适当时间，根据不同实验细胞需求选择适当的孵育条件和时间。

4、加入CCK-8：两种方法，每孔直接加入10ul的CCK-8溶液,或者配置成含10%CCK-8溶液的培养基以换液的形式加入,注意加入过程中避免产生气泡，可以将枪头浸入培养液中缓慢加入。

5、加入CCK-8后孵育时间：将加完CCK-8的培养板放入37°C 5%CO2 培养箱中孵育1-4h，CCK-8试剂加入后孵育时间也需要自己摸索，随着时间的增加，OD值就会增大。可以在0.5h、1.0h、2.0h分别测OD值，把OD值控制在1.0左右。

6、测OD值：将96孔板取出，酶标仪检测各孔在450nm波长处的OD值，分析处理数据，绘制增殖曲线。

7、结果分析

A．细胞存活率：将各测试孔的OD值减去本底OD值（空白组）各重复孔的OD值取平均数±SD。

细胞存活率% =(加药细胞OD/对照细胞OD)×100%。

B. 求出T/C = 50% 时的药物浓度(IC50)及T/C = 10%时的药物浓度(IC90)。

通常研究药物毒性时会涉及半抑制率，即IC50，是指抑制率达50%的时候的药物浓度，把药品稀释成不同浓度，计算各自抑制率，以药品浓度为横坐标、抑制率为纵坐标，得到50%抑制率时候的药物浓度就是IC50。

四、注意事项

1、CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年；

2、若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10ul 0.1M的HCL溶液或者1%(w/v）SDS溶液，并遮盖培养板避光在4℃冰箱中保存，24小时内测定，吸光度不会发生变化；

3、如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基，去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可；

4、当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔加培养基或者PBS，不作为测定孔用；

5、用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定；

6、酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去；

7、CCK8可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果；

8、金属对CCK-8显色有影响：当终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 mM的话，将会100%抑制。